環境微生物的快速測定法

一、菌落染色法
在含有氧化還原顯，色試劑四唑嗡紫羅蘭等的瓊脂平板培養基上培養微生物，或者在普通的瓊脂平板培養基上培養后，經過染色，很容易判別菌落是一種比標準培養時間更短的計測菌落的方法。
微觀染色用于對培養結束的膜過濾器直接滴下染色液，然后讓其干燥，將染成青色的菌落拿到10～20倍的放大鏡下進行計測。培養時間可以縮短到原來方法的1/4～1/2。
二、阻抗法
微生物在增殖過程中會將蛋白質、碳水化合物等高分子化合物，分解成有機酸、氨基酸等離子化合物，這些離子化合物達到一定濃度，在周圍環境中將產生微小的電量變化。將這個電量的變化利用電阻、導電性或者靜電容量這些概念檢測的方法，稱為阻抗法。產生電量與開始時的細菌數、菌的增殖性成反比。因此，從預先求得的兩者的標準曲線中可以推算出樣品中初始的細菌數。作為產品化的系統有氣壓（或液壓）傳輸系統以及細菌計數器。
實際操作如下：往容器中添加液體培養基和樣品，放在組成系統的培養裝置中開始培養。測定機逐時的自動監測培養過程中電量的變化。
本測定方法必須培養，但它和原來計測菌落的方法相比，優點在于培養時間可以縮短。培養開始后直到結果的打印輸出*自動化，初始投資高但運行費用低。另外，通過組合選擇性培養基，可應用于檢測特定微生物。
三、氧化電極法
氧化電極法是一種將微生物增殖過程中的呼吸活性通過氧化電極檢出的方法。與阻抗法一樣，通過自動監測，逐時的測定隨培養進度而產生的培養基中溶解氧的濃度，直到能夠檢出呼吸活性的培養時間，從這一時間推算樣品中的開始菌數。測定時，向裝有氧化極的容器中添加液體培養基和樣品，然后放在組成系統的培養裝置中開始培養，測定機自動監測培養基中溶解氧濃度的逐時變化。6h內就可以檢出105CFU/g的開始菌數。
四、顯色法
顯色法是一種通過標識色素的色調變化來檢測隨微生物代謝產生的培養基pH值的變化和CO₂生成的方法。通過自動監測檢測出培養過程中標識色素的色調變化，從直到可以檢測出色調變化的這一段培養時間推算出樣品中的開始菌數。以培養基pH值變化為指標的維夫斯、以CO_{2生成為指標的敏化培養基/生物材料20都已產品化。
維夫斯使用容器，此容器中盛有包含標識色素的瓊脂層與液體培養基。使用時，向容器中添加樣品，放入組成系統的培養裝置中開始培養。檢出時間受開始菌數多少的影響，但如果達到106CFU，7個小時就可以檢出。通過組合選擇性培養基，也可應用于特定微生物的檢出。}
以上四種方法仍需培養，只是培養時間較傳統方式縮短，有助于改善生物污染控制的工作效率，屬于一類。以下幾種方法則無需培養，屬于另一類環境微生物快速測定法。
五、熒光染色法
利用熒光染色劑熒光染色細胞膜和細胞核等，使用熒光顯微鏡等將細菌檢出的方法。染色機理不同的多種熒光染色劑，根據不同的組合也能識別出活菌和死菌。染色掃描RDI及D計數、真菌監視器掃描、生物絮凝等都已產品化。
染色掃描RDI在薄膜過濾器上過濾樣品，熒光染色阻擋在薄膜過濾器上的微生物后，再進行激光掃描。熒光染色的30min，激光掃描3min即可結束。其結果可以作為圖像表示在監測器畫面上，也可以自動計測產生熒光的點數。D計數以及真菌監視器掃描是結合了熒光染色法與流體檢查計數法的方法，可以連續測定液態樣品。
六、LAL試驗法
LAL試驗法是利用鱟屬的血球抽出物，檢測來源于革蘭氏陰性菌的內毒素的方法。內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁成分的脂多糖，可以作為革蘭氏陰性菌的指標。
七、SLP試驗法
SLP試驗法是利用蠶血液成分檢出肽聚糖及β-葡聚糖的方法。肽聚糖是細菌的細胞壁成本，β-葡聚糖是真菌的細胞壁成分。因此，通過本試驗法能夠檢出這些微生物。不過，每個微生物的肽聚糖及β-葡聚糖含量因菌株不同而差異很大，與LAL試驗法一樣，不能定量微生物，而且也不能識別出式來源于活菌還是死菌。
八、ATP快速測定法
ATP是高能磷酸化合物，分解時產生的能量用于細胞內各種有能量需求的反應。即ATP在地球上所有活著的細胞內發揮著類似于電池的功能，它的存在成為生命活動的證據。
（1）ATP法的測定原理
ATP法是利用螢火蟲尾部發光反應的微生物測定法。來源于螢火蟲的熒光素酶催化反應，以高量子收獲率變換具有ATP的化學能源而發光。反應結果產生的光的數量即發光量和ATP量成正比，通過測定發光量就可以定量ATP。ATP不但存在于細菌體內，而且廣泛存在游離于細菌體外的狀態。細菌外ATP是指從活細菌中溶析出來，細菌死時被逐出，而且被包含在有機污染中。細菌外ATP影響活菌數的測定，因此在前處理階段必須除去。另一方面，驗證潔凈度時，用細菌內外ATP量的總和（ATP總量）為污染指標的方法，在能夠檢出微生物及其溫床污染兩個方面的意義上是合理的。ATP法操作簡單且能快速得到結果。
（2）以菌體內ATP量為指標測定活菌數
根據ATP法求活菌數時，在前處理階段必須除去細菌體外的ATP。除去ATP的方法有酶化分解消去法和薄膜過濾器過濾除去法。酶化法原則上能適用于各種樣品，但含有高濃度的蛋白質和脂肪的樣品，有時不能充分除去細菌體外的ATP，測試前必須確認去除效果。而薄膜過濾器法不能用于引起堵塞的樣品，但它不僅可以除去細菌外的ATP，而且還可以除去妨礙發光反應的物質，進而使微生物濃縮，有助于測試。
（3）空氣中浮游菌數的測定
用空氣取樣器將空氣中浮游菌捕集到瓊脂培養基上進行培養之前，與原來方法相同。原來方法是培養2天后計測出現的菌落，與此相對，利用ATP法檢測細菌成功的將培養時間縮短到6h。
根據NASA標準，在ISO 8級食品廠的潔凈室，取樣空氣量為10ft³的條件下，探討與原來方法的相關性。兩測定值具有相關性，但其相關性很小，只能推算出大致的空氣中浮游菌數。一般認為這是由于多種微生物浮游于空氣中，各種微生物增殖速度和ATP含量不同的緣故。但是，雖不能準確求出細菌數，也可用于判定級別等某種程度上放寬范圍的評價。